단백질 정제 및 특성

단백질 정제 및 특성

순수한 단백질을 세포에서 어떻게 추출하는가?

단일 세포 내에서는 서로 다른 수많은 단백질들이 존재합니다. 어느 단백질이라도 그 한 단백질의 성질을 자세히 연구하려면 한 종류의 분자만으로 구성된 균일한 시료가 있어야 합니다. 단백질의 분리와 정제는 그다음 실험을 위한 필수적인 첫 단계입니다. 일반적으로, 분리 기술은 분자들 간에 차이가 나는 크기, 전하, 극성 등에 초점을 맞추고 있습니다. 오염물질들을 제거하고 대상 단백질의 순수한 시료를 얻기 위해서 여러 가지 기술이 수행된다. 정제 단계들을 거쳐가면서, 정제가 어느 정도 잘 되었는지를 측정하기 위해 단백질의 순도와 회수된 양을 나타내는 표를 만듭니다.

세포에서 단백질의 분리

실제 정제 과정을 시작하기 전에 단백질을 세포와 세포 소기관에서 방출시켜야 합니다. 첫 번째 단계는 균질화(homogenization)라 부르는데, 세포를 파괴하여 여는 과정입니다. 이 과정을 수행하는 데에는 다양한 기술이 있습니다.. 가장 간단한 방법은 조직을 적당한 완충용액과 함께 넣고 믹서기로 가는 것입니다. 세포가 파괴되어 열리고 수용성 단백질이 방출됩니다. 이 과정에서 미토콘드리아, 퍼옥시솜, 소포체 등의 많은 소기관들도 파괴됩니다. 더 온건한 방법은 포터-엘베헴 균질기를 사용하는 것으로, 이 균질기는 벽이나 두꺼운 시험관 안에 이에 꼭 맞는 플런저를 넣었다 뺐다 하는 과정을 통해 단백질을 파괴합니다. 또 다른 방법은 초음파 분해 방법입니다. 음파를 이용하여 세포를 파괴하여 여는 것입니다. 

원심분리기

세포가 균질화되면 분별 원심분리를 수행합니다. 시료를 중력의 600배로 원심 분리하면, 파괴되지 않은 세포와 핵이 침전물로 남게 됩니다. 원하는 단백질이 핵 안에 있지 않다면 이 침전물은 버리면 되고, 그다음 상층액을 더 높은 속도 15,000xg로 원심 분리하면 미토콘드리아가 가라앉게 됩니다. 더욱더 높은 속도 100,000xg로 원심 분리하면 라이보솜과 막의 파편으로 구성된 마이크로솜 분획이 가라앉습니다. 원하는 단백질이 수용성이라면 원심 분리한 상층액을 모으면 되는데, 핵과 미토콘드리아가 제거된 것이므로 이미 부분 정제가 이루어진 셈입니다. 

단백질이 용해된 후에는, 대게 용해도 차이에 근거하여 거친 초벌 정제에 들어갑니다. 황산암모늄은 이 과정에서 가장 흔히 사용되는 시약이며, 이 과정을 가염석출이라 합니다. 단백질은 극성 화합물 및 이온 화합물에 대해 용해도가 다양합니다. 단백질은 물과 상호작용 하기 때문에 녹아 있는 상태로 남아 있습니다. 단백질 용액에 황산암모늄이 첨가되면 단백질에서 물의 일부가 빠져나와 염과 이온-쌍극자결합을 만들게 됩니다. 단백질을 수화하는 데에 사용될 수 있는 물이 적어지므로, 단백질들은 소수성 결합으로 서로 상호작용하기 시작합니다. 황산암모늄이 일정량이 되면, 쓸데없는 단백질들이 포함된 침전물이 형성됩니다. 이러한 단백질은 원심분리로 침전시켜서 제거합니다. 그리고 염을 더 첨가하면,, 보통 원하는 단백질이 포함되어 있는 다른 한 세트의 단백질들이 침전되게 됩니다. 이 침전물은 원심 분리하여 모아서 보관해 둡니다 황산암모늄의 양은 대개 100% 포화 용액을 기준으로 하여 측정합니다. 흔히 사용되는 방법은, 용액을 약 40% 정도 포화되게 만든 다음 생성된 침전물은 원심분리로 제거합니다. 그다음에, 상층액에 황산암모늄을 더 첨가하는데 대개 60~70% 정도 포화되게 합니다. 이때 생성되는 침전물에는 대개 원하는 단백질이 포함되어 있습니다.

-출처- Biochemistry 라이프사이언스 생화학 편 발췌