핵산의 정제와 검출방법

핵 상의 정제&검출

핵산 분리 기술

어떠한 분리 방법이라도 분리될 내용물들 간의 차이점을 이용합니다. 분리에 자주 이용되는 물질의 특성 두 가지는 전하와 크기입니다. 분자생물학에서 가장 널리 이용되는 기술 중 하나인 젤전기영동은 이 두 가지 특성을 모두 이용합니다. 전기영동은 전하를 띤 입자의 전기장에서의 이동에 기초하여 이루어집니다. 전하를 띤 분자가 전기장에서 이동하는 것은 분자의 전하 대 분자의 질량 비에 따라 달라집니다.

 

젤은 틀로 주형을 떠서 만드는데, 연속적으로 교차 결합되어 있는 지지체 상태로 제조됩니다. 교차 결합이 일어나면 구멍이 형성되는데, 이에 사용되는 재료로는 분리될 분자의 크기에 따라서 아가로오스나 폴리아크릴아마이드 중의 하나를 선택합니다. 크기가 큰 분자들을 분리하는 데는 아가로오스를, 작은 분자들을 분리하는 데는 폴리아크릴아마이드 젤을 사용합니다.

 

분리될 분자들이 갖고 있는 전하 때문에, 분자들은 반대 전하를 띤 전극 쪽으로 젤을 통해 이동하게 됩니다. 핵산과 올리고뉴클레오타이드 조각에 있는 인산기 때문에 중성 pH에서는 음전하를 띱니다. 음전하를 띤 이 분자들이 두 전극 사이의 전기장에 놓이게 되면, 이것들은 모두 양전극을 향해 이동합니다. 핵산의 경우, 그 핵산 조각의 전체 전하는 각각의 뉴클레오타이드 잔기에 있는 인산기의 음전하가 합쳐져서 나타나지만, 핵산이나 올리고뉴클레오타이드의 질량도 그에 상응하여 증가합니다. 따라서 질량에 대한 전하의 비율은 문제의 분자 크기와는 상관없이 대략적으로 일정하게 유지됩니다. 결과적으로, 단순히 크기별로 분리되게 되며, 이는 젤이 체 역할을 하기 때문입니다.

젤전기영동

 

올리고큐클레오타이드 혼합물로 이루어진 시료를 주어진 시간만큼 전기영동으로 분리하면, 작은 올리고튜클레오타이드일수록 큰 올리고뉴클레오타이드보다 더 멀리 이동합니다. 올리고뉴클레오타이드는 자신의 전하 때문에 전기장 내에서 이동하며, 주어진 시간 동안의 이들의 이동거리는 크기에 따라 달라집니다.

 

대부분의 분리 작업은 수평으로 놓인 아가로오스 젤을 사용하여 수행하는데, 용기 안에 완충 용액을 담고 젤은 실제로 완충용액의 바닥에 잠기게 하여 사용하기 때문에 잠수함 젤이라고 불립니다. 그렇지만 DNA 염기서열을 결정할 때는, 폴리아크릴아마이드 젤을 수직으로 놓고 전기영동을 수행합니다.

 

핵산 검출 방법

DNA 조각들을 분리한 후에는 분리된 것들이 보이게 하려면 이것들을 어떤 박식으로든 처리를 해야 합니다. 일부 방법을 사용하면 모든 DNA가 다 나타나게 할 수 있지만, 특정 DNA 조각만을 특이적으로 나타나게 하는 다른 방법도 있습니다.

 

분리된 산물들을 검출하는 원래 방법은 시료를 방사능으로 표지하는 방식에 근거한 것입니다. 표지 또는 꼬리표란 다른 분자를 볼 수 있게 만들어주는 원자 또는 분자를 말합니다. 과거에는 이런 목적으로, 질량수가 32인 인의 동위원소가 널리 사용되었습니다. 최근에는 질량수가 35인 황의 동위원소가 널리 사용되고 있습니다. 방사는 동위원소가 DNA내에 편입되도록 DNA 분자를 반응시킵니다. 표지 된 올리고뉴클레오타이드를 분리한 후, 젤에 X-선 필름 한 장을 붙여놓습니다. 방사능으로 표지 된 올리고뉴클레오타이드가 이들이 접촉하고 있는 필름 부위를 감광시킵니다. 필름을 현상하면 표지 된 물질이 있는 위치가 검은 띠로 나타납니다. 이런 기술을 자가방사기록법이라 하며, 이렇게 만들어진 필름 영상이 자가방사기록입니다.

 

DNA 염기서열을 결정하려 할 때에는 각 염기에 한 가지씩 네 가지로 이루어진 일련의 형광 화합물을 표지로 사용합니다. 산물들이 분리되어 있는 젤에 레이저를 쪼여주는데, 레이저 빛의 파장은 네 가지 표지들이 각각이 흡수하는 파장입니다. 네 가지 표지화합물들 각각은 서로 다른 고유의 긴 파장에서 빛을 재방사합니다. 이것을 형광이라고 합니다. 

 

형광을 이용하는 또 다른 검출 방법은 화합물 에티듐 브로마이드를 사용하는 것입니다. 에티듐 브로마이드의 분자구조는  DNA 염기들 사이로 미끄러져 끼어 들어갈 수 있는 평면 부분이 있어서, 이것이 DNA와 결합하면 용액에 혼자 녹아 있을 때와는 다른 형광 특성을 나타냅니다. 젤 안에 있는 DNA를 염색하는 데에는 에티듐 브로마이드 용액이 사용됩니다. 용액이 젤에 스미게 한 다음 젤에 자외선을 비추면, 젤에 있는 DNA 조각들을 주황색 띠로 볼 수 있습니다.

-출처- Biochemistry 라이프사이언스 생화학 편 발췌